Promotor do gene PGK1 de Pichia pastoris para expressao heterologa

A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para a expressăo de várias proteínas heterólogas sendo que diversos vetores já foram desenvolvidos para este sistema. Os principais vetores de expressăo de P. pastoris săo baseados no promotor do gene AOX1 que codifica a enzima álcool oxidase 1. Alguns estudos tęm sido realizados para o uso de promotores alternativos. Em nosso laboratório foi isolado e caracterizado o promotor do gene PGK1 de P. pastoris (PPGK1), um promotor forte e constitutivo, que representa uma alternativa promissora para a construçăo de novos vetores. O objetivo deste estudo foi determinar a regiăo promotora mínima do PPGK1 por meio de deleçőes controladas utilizando o gene da a-amilase de Bacillus subtilis como gene repórter. Quatro deleçőes foram obtidas sendo que a menor (PPGKż3), com ~400 pb, manteve atividade promotora. Foi demonstrado que esta seqüęncia é capaz de dirigir a integraçăo de um vetor no genoma de P. pastoris e 51% dos clones transformantes tiveram mais de uma cópia integrada. O uso deste promotor propiciou a expressăo heteróloga de a-amilase em altos níveis (250 U.mL-1).